1-  هدف:

این محیط كشت در ارزیابی فعالیت دزوكسی ریبونوكلئاز (DNase) باكتری ها و قارچ ها و خصوصاً به عنوان كمك در تشخیص استافیلوكوك های بیماری زا بكار می رود.

with Toluidine  Blue Test Agar DNase برای كمك در تفكیك و تشخیص گونه سراشیای بدون پیگمان كه ممكن است به اشتباه  بعنوان گونه انتروباكتر و كلبسیلا تشخیص داده شوند، به كار می رود.

 

2-  اساس آزمایش:

اگر استافیلوكوك آنزیم DNase  داشته باشد این آنزیم، اسیدنوكلئیك را هیدرولیز می نماید كه با استفاده از معرف و ایجاد هاله شفاف در اطراف محل رشد باكتری می توان به این موضوع پی برد.

ویژگی های آزمایش:

حساسیت: 99% استافیلوكوك های كواگولاز مثبت،  DNase مثبت نیز هستند.

اختصاصیت:20% استافیلوكوك های كواگولاز منفی، DNase مثبت هستند.                         

3-  نمونه اولیه:

پلیت های LEMB Agar  یا Sheep Blood Trypticase Soy Agar with 5% حاوی
ارگانیسم مورد نظر

4-  مواد و ابزار مورد نیاز: 

-       پلیت  Test Agar DNase 

-       معرف اسید كلریدریك 1N (یك نرمال) یا معرف تولوئیدین بلو 1/0%  

توجه : پلیت هایwith Toluidine  Blue  Test Agar DNase را می توان مستقیماً بدون افزودن معرف بررسی نمود، چون خود محیط كشت حاوی  g/lit 05/0 از ماده Toluidine Blue O     می باشد. مقدار این ماده در محیط كشت نباید از 005/0 %  تجاوز كند چون در غلظت های بالاتر ممكن است  شناسایی فعالیت DNase  را مشكل سازد.

5-  روش انجام كار:

پلیت های  DNase Test Agar یاDNase Agar with Toluidine Blue  را با نمونه مورد نظر به صورت نقطه ای (یا خطی) تلقیح نمایید. پلیت ها را به مدت 24-18 ساعت در دمای°2 ± 35 سانتی گراد انكوبه نمایید. پس از انكوباسیون، روی پلیت های DNase Test Agar  ساده، اسید كلریدریك 1 نرمال و یا تولوئیدین بلو 1/0% بریزید به گونه ای كه سطح پلیت را كاملاً بپوشاند و سپس آن را بر روی زمینه تیره قرار داده و بررسی نمایید. تلقیح باید نقطه ای باشد، چون بعضی از سویه های استافیلوكوك اورئوس به خوبی بر روی محیط، رشد نمی كنند و در نتیجه میزان رشد برای ارزیابی فعالیت DNase كافی نخواهد بود. در صورت تلقیح نقطه ای، حتی اگر در محل تلقیح، رشدی ایجاد نشود می توان فعالیت DNase را ارزیابی نمود.

 

-   DNase Test Agar که اسید كلریدریك یک  نرمال روی آن ریخته شده است .

a) مثبت : فوراً هاله های شفاف كاملاً مشخصی اطراف كلنی یا محل تلقیح را در محیط كشت احاطه می كنند.

b) منفی : اطراف كلنی ها یا محل تلقیح شفاف نمی شود.

 

- DNase Test Agar که تولوئیدین بلو 1/0% روی آن ریخته شده است :

a)   مثبت: هاله های شفاف قرمز صورتی ،اطراف كلنی یا محل تلقیح را احاطه می كنند. محیط در جایی كه DNA باقی مانده باشد آبی می شود.

b)   منفی: هاله های كدر قرمز صورتی اطراف كلنی یا محل تلقیح را احاطه می كنند.

 

-       پس از انكوباسیون روی پلیت هایDNase Test Agar With Toluidine Blue  ، معرف ریخته نمی شود و مستقیماً بررسی می گردد.

a)   مثبت (+): هاله شفاف قرمز صورتی واضحی اطراف كلنی یا محل تلقیح را در یك محیط آبی (نیلی) احاطه می كند.

b)  منفی (-): بدون تغییر، محیط به رنگ آبی تیره شفاف باقی می ماند.

 

6-   برنامه كنترل كیفی (QC):

 

:DNase Test Agar

Staphylococcus aureus ATCC 25923 : رشد متوسط تا زیاد، احاطه شده با هاله شفاف
صورتی تا قرمز (كنترل مثبت)

Staphylococcus Epidermidis ATCC 12228: رشد متوسط تا زیاد، بدون هاله (كنترل منفی)

DNase Test Agar with Toluidine Blue :

Klebsiella Pneumoniae ATCC  33495 : رشد متوسط تا زیاد، بدون هاله (كنترل منفی)

Serratia  marcescens ATCC 13880: رشد متوسط تا زیاد، احاطه شده با هاله صورتی شفاف (كنترل مثبت)

7-  تداخلات: 

بعضی از سویه های استافیلوكوك ممكن است روی DNase Test Medium with Toluidine Blue مهار شوند.

پروتئوس ولگاریس، سودوموناس آئروژینوزا و آئروموناس، واكنش های مثبت زیادی برای تولید DNase نشان می دهند.